摘 要 本研究对5个木薯品种进行核型分析以揭示其核型特征，通过聚类分析来自4个产地的5个品种间的相似性，以探讨其亲缘关系。实验采用压片法，以木薯嫩叶为材料，运用DPS软件对核型资料按照最长距离法进行聚类分析。结果表明，木薯5个品种的染色体数目均为2n=36，其中，SC12的核型公式为2n=36=34m+2sm，SM2300-1的核型公式为2n=36=36m（4SAT）、桂热5号的核型公式为2n=36=36m，云南8号与ZM8752的核型公式均为2n=36=34m（4SAT）+2sm。核型不对称系数范围在56.58～58.85之间，核型类型依次为1A、1B、1B、2A、1A，对称程度较高。聚类结果显示，在遗传距离为0.4时，5个品种分为3类。第Ⅰ类为云南8号，第Ⅱ类包括ZM8752与SM2300-1，第Ⅲ类包括SC12和桂热5号，5个品种存在一定的核型差异，说明具有丰富的遗传多样性。
关键词 木薯;核型分析;聚类分析中图分类号 S533 文献标识码 A
Karyotype and Cluster Analysis of Five Cassava （Manihot esculenta Crantz） Varieties
LI Xiaoli1，2， HE Xinya1， XIAO Xinhui2， GAO Heqiong1， ZHUANG Nansheng1， WANG Ying1*
1. Institute of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou， Hainan 571737， China
Abstract Karyotype analysis was performed on five cassava cultivars to reveal the karyotype characteristics. The similarity and genetic relationship among the five cultivars were analyzed by cluster analysis， using young leaves as the materials and the squashing method to analyze the features of chromosomes. The results showed that the chromosome number of the five varieties was 2n=36， and the karyotype formula of SC12， SM2300-1， Guire No. 5 was 2n=36=34m+2sm， 2n=36=36m（4SAT）， 2n=36=36m， respectively， and that of both Yunnan No. 8 and ZM8752 was 2n=36=34m（4SAT）+2sm. The asymmetrical karyotype coefficient was ranged from 56.58 to 58.85， and the karyotype types was 1A， 1B， 1B， 2A and 1A， respectively. The degree of symmetry was high. The clustering results showed that when the genetic distance was 0.4， the five varieties were divided into 3 categories. The first category was Yunnan No. 8， the second category included ZM8752 and SM2300-1， and the third category included SC12 and Guire No. 5. The five cultivars had certain karyotype differences， indicating that they had abundant genetic diversity.
Keywords cassava; karyotype analysis; cluster analysis
DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.012
木薯（Manihot esculenta Crantz）是世界三大薯类之一，是重要的粮食作物[1]。目前中国热带农业科学院热带作物种质资源研究所国家木薯种质资源圃保存了228份木薯种质资源，其中国内资源105份[2]。核型是生物遗传物质在细胞水平上的表征，与外部形态相比，其受外界环境因素影响较小，更能保持相对稳定[3]。1935年，木薯染色体的数目由Garner[4]率先報道。随后，一些研究者以木薯花粉母细胞[5]、木薯根尖[6-7]、木薯叶片[8-9]为材料进行制片技术研究与核型分析。其中De等[10]利用木薯根尖研究了47份木薯减数分裂时染色体形态的相似性;Nassar等[11]结合细胞遗传学和形态学手段对木薯嵌合体进行了研究;冯耀文[12]对华南6号、王婧菲等[13]对华南8-11号染色体的数量、大小、相对长度等进行分析;叶剑秋[14]、曾霞等[6]利用分子标记的统计数据对木薯种质进行聚类分析，讨论种质间的相似性与亲缘关系，但根据木薯核型资料进行聚类分析的研究未见报道。
本研究根据木薯各品种的核型特征、核型参数进行聚类分析，以探索品种间的亲缘关系，从而揭示不同地区品种的差异性，丰富木薯的遗传多样性，为木薯育种提供理论依据。同时，为木薯种质资源鉴定和细胞遗传图谱的构建提供细胞学基础。
1 材料与方法
1.1 材料
SC12、云南8号、SM2300-1、桂热5号、ZM8752等5个木薯品种由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所国家木薯种质资源圃提供，染色体核型分析所用材料为5个品种的新鲜嫩叶，具体信息见表1。
1.2 染色体标本制备与核型分析
染色体标本的制备采用刘永安等[15]以及李懋学[16]报道的压片技术。取木薯的嫩叶，置于4 ℃饱和对二氯苯溶液下预处理2 h后用卡诺氏固定液（V无水乙醇∶V冰醋酸=3∶1）于4 ℃条件下固定24 h，最后保存在75%酒精中。实验时，将叶片放入60 ℃、1 mol/L 盐酸中解离15～18 min，经改良卡宝品红染色液染色4～24 h后，用解剖针取叶边缘少量组织进行压片。
用Olympus BX51显微镜对染色体分散且形态清晰的中期细胞拍照，核型分析软件为Photoshop CS5，Image J进行数据測量。核型分析标准按照李懋学等[17]的方法，染色体类型参考Levan等[18]的命名法则，核型分类采用Stebbins[19]的分类标准，核型不对称性系数用Arano[20]的方法计算。
1.3 数据处理
根据5份木薯种质的染色体随体数目、臂比平均值、臂比方差、核型不对称系数、相对长度方差、最长染色体与最短染色体长度比值、sm染色体比例、m染色体比例等8项参数，采用DPS软件对实验数据进行聚类分析。
2 结果与分析
2.1 5个木薯品种的核型分析
根据李懋学等[17]的规则，每个品种中选择30个分散良好的染色体细胞进行观察计数，具有36条染色体的细胞占85%。按照标准化核型分析，5个品种染色体数目均为2n=2x=36，与前人的报道一致[4-5]。
桂热5号的染色体组由长染色体（L）、中长染色体（M2）、中短染色体（M1）和短染色体（S）组成，均为中部着丝粒染色体（m）（表2，图1），核型不对称系数为56.58%，相对长度变化范围为3.66%～7.93%，平均臂比为1.30，臂比>2的染色体百分比为0，核型公式为2n=36=36m，核型为1B型（表3）。
云南8号的染色体由中长染色体（M2）、中短染色体（M1）组成，仅14号染色体为近中部
着丝粒染色体（sm），其余均为中部着丝粒染色体（m）（表2，图1），核型不对称系数为58.55%，相对长度范围为4.39%～6.86%，平均臂比为1.44，第11号染色体臂比>2，百分比为5.56%，第15、18号染色体短臂端有随体，核型公式为2n=36= 34m（4SAT）+2sm，核型为2A（表3）。
ZM8752的染色体组由长染色体（L）、中长染色体（M2）、中短染色体（M1）和短染色体（S）组成，仅7号染色体为近中部着丝粒染色体（sm），其余染色体均为中部着丝粒染色体（m）（表2，图1），核型不对称系数为57.86%，相对长度变化范围为3.77%～7.42%，平均臂比为1.38，臂比>2的染色体百分比为0，第2、11号染色体短臂端有随体，核型公式为2n=36= 34m（4SAT）+2sm，核型为1A（表3）。
SM2300-1的染色体组由长染色体（L）、中长染色体（M2）、中短染色体（M1）和短染色体（S）组成，均为中部着丝粒染色体（m）（表2，图1），核型不对称系数为57.36%，相对长度范围为3.57%～7.78%，平均臂比为1.34，臂比>2的染色体百分比为0，第5、7号染色体短臂端有随体，核型公式为2n=36=36m（4SAT），核型为1B（表3）。
SC12染色体组由长染色体（L）、中长染色体（M2）、中短染色体（M1）和短染色体（S）组成，仅3号染色体为近中部着丝粒染色体（sm），其余染色体均为中部着丝粒染色体（m）（表2，图1），核型不对称系数为58.85%，相对长度变化范围为4%～7.13%，平均臂比为1.44，臂比>2的染色体百分比为0，核型公式为2n=36=34m+ 2sm，核型为1A（表3）。
5个木薯品种中，除云南8号外，SC12、ZM8752、SM2300-1、桂热5号的染色体组成相同;云南8号、ZM8752、SM2300-1均有2条染色体的短臂带有随体，而SC12、桂热5号染色体无随体;SM2300-1相对长度范围最广;云南8号臂比范围广;核不对称系数从小到大排列依次是桂热5号、SM2300-1、ZM8752、云南8号、SC12，即SC12核型不对称系数最高，总体上5个木薯品种染色体较对称。
2.2 5个木薯品种的聚类分析
染色体是遗传物质的载体，不同物种、不同品种之间的染色体核型存在一定的差异[21]。因此，基于染色体核型对品种进行区分和聚类是可靠的。5个木薯品种遗传距离的变化范围为0.25～ 4.07，变化范围小，说明品种之间具有一定的相似性。其中，ZM8752与SM2300-1的遗传距离最小，为0.25，说明相似性程度较高，亲缘关系最近;其余品种遗传距离均大于0.3，占供试品种的60%，说明遗传多样性也较为丰富。从图2可以看出，在遗传距离为0.4时，5个品种分为3类。第一类为云南8号，其臂比>2的比例为5.56%，随体数为4;第二类包括ZM8752与SM2300-1，随体数均为4，核型不对称系数相差0.005;第三类包括SC12和桂热5号，随体数为0，核型不对称系数相差0.0227。在遗传距离大于1.0时，又可以分为2类，分别为云南8号/ZM8752/SM2300-1、SC12/桂热5号。
3 讨论
植物染色体制片有压片、切片、酶解等方法，本研究通过对比叶片上中下各部位组织取材制片的结果，发现叶片中上部容易获得较多的分裂相。凡杰等[8]根据叶片不同部位的纤维素含量以及分裂相的数量对木薯嫩叶制片时取材的部位进行了仔细研究，最后得出木薯叶片中部是获得分裂相的最佳部位;张健等[9]也认为木薯嫩叶叶缘中上部组织能获得较多分裂相细胞。在其他物种上，顾蔚等[22]认为华中五味子幼叶5～15 mm侧边组织也是制片的适宜部位。由此说明叶片确实是制片的适宜材料，分裂相密集的位置为叶缘中上部。
本研究的5个品种中，SC12与ZM8752的核型类型一致，均为1A，属于对称核型，与王婧菲等[13]研究中的SC8、SC9、SC10核型类型一致;桂热5号与SM2300-1的核型类型均为1B，属于比较对称核型，与冯耀文[12]报道的SC6核型类型一致;云南8号为2A。按照Stebbins[19]的观点，高等植物核型进化的基本趋势是由对称向不对称发展，在系统演化上比较古老或原始的植物往往具有较对称的核型，不对称的核型通常出现在较进化或特化的植物中。本研究的5个木薯品种中，桂热5号的核不对称系数最低，较之云南8号、SM2300-1、SC12、ZM8752更为进化，SC12核不对称系数最高，为原始类型。
采用DPS软件对核型参数进行聚类以讨论种质间的相似性已经在藿香[3]、人参[23]、玉米[21]、苹果[24]、荆芥[25]等物种上有过报道。本研究首次利用木薯5个品种核型资料进行聚类分析，结果显示，在遗传距离为0.4时分为3类，在遗传距离大于1.0时聚为2类，分别是云南8号、ZM8752、SM2300-1为一类，SC12、桂热5号为第二类。这在一定程度上与叶剑秋[14]采用SSR标记的基因型数据统计结果聚类时，SM2300-1、桂热5号各为一类，ZM8752与云南8号为一类的结果相似。出现差异的原因可能是2种标记研究对象的水平层次不同：SSR分子标记覆盖整个基因组，多态性高[26]，而细胞学标记涉及每条染色体的形态。但同时也说明核型参数作为细胞学标记通过聚类来进行品种鉴定、亲缘关系分析具有一定的可行性，与分子标记相比，核型分析具有直观、简单易行的优势，同时提供了将细胞学标记与分子标记相结合来分析种质间相似性并相互印证的思路。
参考文献
[1] 丁慧敏， 谢彩锋， 古 碧， 等. 木薯块根的营养价值及消化性能[J]. 食品研究与开发， 2015， 36（20）： 193-196.
[2] 肖鑫辉， 李开绵， 许瑞丽， 等. 国内外栽培木薯（Manihot esculenta Crantz）种质资源表型多样性分析[J]. 植物遗传资源学报， 2017， 18（1）： 94-105.
[3] 苏芸芸， 王康才. 不同产地藿香核型及似近系数聚类分析[J]. 核农学报， 2017， 31（6）： 1053-1060.
[4] 庄南生， 梁达德. 木薯核型的研究[J]. 熱带农业科学， 1997（1）： 33-35.
[5] Magoon M L， Bai K V. Morphology of the pachytene chromosomes and meiosis in Manihot esculenta Crantz[J]. Cytologia， 1969， 34（4）： 612-626.
[6] 曾 霞， 庄南生， 李开绵. 木薯染色体的C-分带研究[J]. 热带作物学报， 2003， 24（4）： 52-56， 85.
[7] 冯 斗， 王建岭， 席世丽， 等. 木薯根尖染色体的观察技术[J]. 安徽农业科学， 2008， 36（9）： 3711-3712.
[8] 凡 杰， 安飞飞， 郑 峰. 木薯嫩叶染色体的制片方法[J]. 热带生物学报， 2012， 3（2）： 135-137.
[9] 张 健， 郭军辉， 陈雄庭， 等. 木薯叶片染色体制片技术研究[J]. 热带作物学报， 2012， 33（1）： 20-23.
[10] De C R， Guerra M. Cytogenetics of Manihot esculenta Crantz （cassava） and eight related species[J]. Hereditas， 2002， 136（2）： 159-168.
[11] Nassar N M， Bomfim N. Synthesis of periclinal chimera in cassava[J]. Genetics & Molecular Research Gmr， 2013， 12（1）： 610.
[12] 冯耀文. 木薯SBEⅡ和MeEFⅠ基因物理定位的研究[D]. 海口： 海南大学， 2011.
[13] 王婧菲， 王 超， 陈学俊， 等. 木薯4个品种的核型分析[J]. 热带作物学报， 2012， 33（10）： 1715-1719.
[14] 叶剑秋. 木薯种质资源遗传多样性评价与创新利用[D]. 海口： 海南大学， 2014.
[15] 刘永安， 冯海生， 陈志国， 等. 植物染色体核型分析常用方法概述[J]. 贵州农业科学， 2006， 34（1）： 98-102.
[16] 李懋学. 植物染色体研究技术[M]. 哈尔滨： 东北林业大学出版社， 1991.
[17] 李懋学， 陈瑞阳. 关于植物核型分析的标准化问题[J]. 武汉植物学研究， 1985， 3（4）： 297-302.
[18] Levan A， Fredga K， Sandberg A A. Nomenclature for centromeric position on chromosomes[J]. Hereditas，1964， 52（2）： 201-220.
[19] Stebbins G. L. Chromosomal evolution in higher plants[M]. London： Edward Arnold （Publishers） Ltd.， 1971.
[20] Arano H. Cytological studies in subfamily Carduoideae （Compositae） of Japan IX. The karyotype analysis and phylogenic considerations on Pertya and Ainsliaea （2）[J]. Shokubutsugaku Zasshi， 1963， 76（895）： 32-39.
[21] 姚啟伦， 陈发波， 何章帅， 等. 基于染色体核型的玉米地方品种聚类分析[J]. 河南农业科学， 2017， 46（6）： 34-38.
[22] 顾 蔚， 卜海东， 张成艳， 等. 华中五味子染色体制片优化及核型分析[J]. 西北植物学报， 2008， 28（2）： 2262-2266.
[23] 梁 韶， 宋 娟， 雷秀娟， 等. 四种人参属药用植物的核型分析[J]. 人参研究， 2017（2）： 6-10.
[24] 马衣努尔姑·吐地， 张延辉， 秦 伟， 等. 新疆野苹果的不同种下类型染色体核型分析[J]. 中国农业科学， 2016， 49（8）： 1540-1549.
[25] 段英姿， 马艳芝. 不同产地荆芥核型及核型似近系数聚类分析[J]. 中国药学杂志， 2017， 52（15）： 1313-1318.
[26] 贾继增. 分子标记种质资源鉴定和分子标记育种[J]. 中国农业科学， 1996（4）： 2-11.