李朝阳 陶拉娣 胡先明 郭晓燕 武素梅 王文杰 王丽燕 孙晓俐 贾利芳
摘要：目的 用超高倍显微镜检测儿童化脓性脑膜炎脑脊液中细菌及细胞学的变化。方法 选取36例怀疑中枢神经系统感染的患儿，通过腰椎穿刺获取脑脊液，运用超高倍显微镜在不进行染色的情况下进行脑脊液检测。结果被检测的36例疑似颅内感染的病例中，诊断为化脓性脑膜炎13例，合并硬膜下积液4例，合并脑室扩大者2例。其中脑脊液超高倍显微仪检出细菌阳性12例，硬膜下积液中检出细菌阳性3例。被捡出的细菌在超高倍显微镜下观察，寄生于中性粒细胞或单核细胞胞浆中，为成对或散在的圆形发光颗粒，活动性强。此外，在疾病的不同临床阶段，观测到脑脊液的细胞学分类差别很大。结论超高倍显微镜可提高化脓性脑膜炎脑脊液中细菌的检出率。
关键词：化脓性脑膜炎；细菌；超高倍显微镜
中图分类号：R512.3 R256.51 文献标识码：B 文章编号：1672-1349(2007)07-0653-02
化脓性脑膜炎的诊断，传统的方法依靠脑脊液的低倍显微镜检查和生化检查以及低倍显微镜的涂片染色镜检。而低倍显微镜涂片镜检必须首先进行染色，这样在显微镜下看到的染色后的微生物标本是死的，在染色过程中微生物的形态与结构均会发生一些变化，不能完全代表其活细胞的真实情况，而且检出率不高，尤其是在用过抗生素患儿的脑脊液中。既往对化脓性脑膜炎的诊断更多地依靠细胞学的分类和脑脊液细菌学培养，但是细菌学培养费时而且在使用过抗生素的患儿中阳性率不高。超高倍显微镜可以在不进行染色的情况下看到活的细菌，可成为化脓性脑膜炎快速简便的诊断方法。
1 资料与方法
1．1 检测对象本组检测的临床病例36例，均为2006年1月—2006年6月在山西省儿童医院内科住院的临床疑似颅内感染的患儿，>6个月10例，6个月至1.0岁12例，1.1岁～3.0岁5例，3.1岁5.0岁6例，5.1岁～13.0岁3例，全部做脑脊液常规生化、常规检查、细菌培养、普通光学显微镜涂片镜检(革兰氏染色)及超高倍显微镜镜检。
1．2 仪器 清华同方THMI－UP型清华显微仪(放大倍数10000倍)。
1．3 检测方法 常规腰椎穿刺，留取脑脊液2mL。取1滴标本于载玻片上，压盖玻片后置于超高倍显微镜下全片观察。脑脊液和硬膜下积液置细菌培养液(血平板、巧克力平板、伊红美蓝平板、营养琼脂平板)中，每例标本都在4种培养液中培养。
2 结果
被检测的36例疑似颅内感染的病例中，确诊为化脓性脑膜炎13例，无菌性脑膜炎18例(其中3例发病前2周内有腮腺肿大病史)，急性播散性脑脊髓炎2例，急性小脑共济失调2例，重症肺炎合并中毒性脑病1例。
13例化脓性脑膜炎病例中，合并硬膜下积液4例，合并脑室扩大者2例。其中脑脊液经超高倍显微镜检出细菌阳性12例，其中经细菌学培养证实者8例。硬膜下积液中检出细菌阳性3铆(经细菌学培养证实)。普通低倍显微镜涂片镜检检出细菌阳性5例。另外1例脑脊液细菌培养为阴性，镜下检菌阳性，临床表现(发热、头痛、颈抵抗阳性、克氏征阳性)、脑脊液常规检查和脑脊液生化(经细胞学分类显示细胞数2008×106/L，中性粒细胞0.8，淋巴细胞0.2，脑脊液生化显示蛋白增高1.6g/L，葡萄糖减低，脑脊液，血葡萄糖比率<0.23)、头颅CT显示有硬膜下积液，由于化脓性脑膜炎脑脊液的细菌培养阳性率只有70％～85％，故根据临床仍诊断为化脓性脑膜炎。
其中脑脊液中培养的8例阳性细菌分别为：表皮葡萄球菌2例，化脓性链球菌2例，肺炎链球菌2例，星形奴卡菌1例，凝固酶阴性葡萄球菌1例。硬膜下积液中培养的3例阳性细菌分别为：表皮葡萄球菌1例，凝固酶阴性葡萄球菌1例，化脓性链球菌1例。
从不同的年龄组来分析，>6个月的患儿发病率和检出率最高。被检出的细菌在超高倍显微镜下观察，寄生于中性粒细胞或单核细胞胞浆中，为成对或散在的圆形发光颗粒，活动性强。此外，在疾病的不同临床阶段，脑脊液的细胞学分类差别很大。
在疾病的初期，细胞数目明显增多，以中性粒细胞和单核细胞居多，细胞体积普遍增大，细胞内颗粒多，细胞的活动性强，常常可以看到空泡现象、中毒颗粒及伪足；其中1例可以看到单核细胞明显增大，胞浆内颗粒增多并有布朗运动，其中细胞核的形状在不停的变化，由马蹄形逐渐变为圆形。
在疾病的恢复期，整个视野中很难发现细胞，偶尔会发现散在的淋巴细胞，细胞体积明显减小，细胞内没有颗粒，没有空泡现象和伪足。
18例无菌性脑膜炎中，根据脑脊液镜检和培养除外细菌和真菌感染，主要特征均有脑膜刺激症状和脑脊液细胞增多，符合无菌性脑膜炎诊断标准。脑脊液的生化指标均正常，细胞数虽然有增多，但是均<100×106/L，且以淋巴细胞为主，这些增多的淋巴细胞有时会出现伪足。涂片中偶见中性粒细胞，但是体积不增大，没有空泡现象。
3 讨论
炎症通常可依病程经过分为两大类：急性炎症和慢性炎症。急性炎症起病急骤，持续时间短，仅几天到1个月，以渗出病变为其特征，炎症细胞浸润以粒细胞为主。慢性炎症持续时间较长，常数月到数年，常以增生病变为主，其炎症细胞浸润则以巨噬细胞和淋巴细胞为主。
吞噬作用是生物体最古老的，也是最基本的防卫机制之一。对于其要消灭的对象无特异性，在免疫学中称之为非特异性免疫作用。中性粒细胞内的颗粒为溶酶体，内含多种水解酶，能消化其所摄取的病原体或其他异物。细胞在对刺激因子进行适应时，能肥大、增生。
中性粒细胞受到炎症刺激后也会体积增大。一般1个白细胞处理5个～25个细菌后，本身也就死亡。死亡的白细胞集团和细菌分解产物构成脓液。
化脓性脑膜炎属于化脓性炎症，以大量中性粒细胞渗出为特征。脓液中的中性白细胞除少数仍可保持其吞噬功能外，大多数已发生变性和坏死，即变为脓细胞。单核细胞由骨髓生成，在血液内仅生活(3～4)d，即进入_肝、脾、肺和淋巴等组织转变为巨噬细胞。变为巨噬细胞后，体积加大，溶酶体增多，吞噬的消化能力也增强。但其吞噬对象主要为进入细胞内的致病物，如病毒、疟原虫和细菌等。细菌粘着在吞噬细胞表面之后，吞噬细胞伸出伪足将其包围，随伪足延伸，互相吻合，形成由吞噬细胞膜包围吞噬物的泡状小体，谓之吞噬体。
超高倍显微镜可以清楚地看到白细胞的吞噬现象，而中性粒细胞内中毒颗粒增多表示病情严重，中毒颗粒减少或者消失，表明病情好转或者痊愈。在化脓性脑膜炎的诊断中，运用超高倍显微镜检测脑脊液，可以看到分叶核细胞、单核细胞以及它们的吞噬现象，尤其是可以看到细胞内吞噬的细菌这一金标准，进而对化脓性脑膜炎的病因诊断和疾病活动状态进行准确的判断，相对于传统光学显微镜的放大倍数400、油镜1000来说，本实验使临床诊断的准确率达到了一个新的高度。
由于化脓性脑膜炎的常见细菌，如脑膜炎奈瑟氏菌离体后迅速自溶，肺炎链球菌及流感嗜血杆菌也易死亡。脑脊液无论做涂片或者培养，必须于采集后立即送检，否则影响检出率。多数细菌的大小在0.3μm～5.0μm。超高倍显微仪的分辨率可以达到0.3μm。因此，使用超高倍显微镜可以在涂片下迅速对细胞内的细菌做出辨认，对化脓性脑膜炎快速做出诊断，进而提高检出率。
(本文编辑 王雅洁)