〔摘要〕 目的 检测五味消毒饮不同分离部位的体外抗菌活性，为五味消毒饮的二次开发提供实验依据。方法 本研究将五味消毒饮水煎液用NKA-9大孔树脂进行吸附分离得到不同部位的洗脱液，用牛津杯法测定其抑菌圈，并用试管稀释法检测洗脱液对细菌的最低抑菌浓度（MIC）。结果 各分离部位对不同菌株的抑菌效果有显著差异，30%乙醇洗脱液对金黄色葡萄球菌和志贺氏痢疾杆菌的抑制效果最好，MIC分别为0.055 g/mL和0.150 g/mL；而水洗液对肺炎链球菌杆菌的抑制效果最佳，MIC为0.184 g/mL，对金黄色葡萄球菌和志贺氏痢疾杆菌没有抑制作用；水洗液、10%乙醇洗脱液、30%乙醇洗脱液对绿脓杆菌几乎没有抑制效果，极性稍小的50%乙醇洗脱液、70%乙醇洗脱液、90%乙醇洗脱液对绿脓杆菌有较弱的抑制效果。结论 五味消毒饮的不同分离部位对不同细菌的抑制效果不同，为经典方剂“五味消毒饮”的二次开发提供了理论依据和数据支持。
〔关键词〕 五味消毒饮；NKA-9大孔树脂；最低抑菌浓度；洗脱液
〔中图分类号〕R285.5；R284.2 〔文献标志码〕A 〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.08.004
〔Abstract〕 Objective To investigate the in vitro antibacterial activity of different separated parts of Wuwei Xiaodu Decoction， and to provide an experimental basis for the secondary development of Wuwei Xiaodu Decoction. Methods The water extract solution of Wuwei Xiaodu Decoction was absorbed and separated by NKA-9 macroporous resin to obtain the eluent of each part. The Oxford cup method was used to measure the inhibition zone， and the tube dilution method was used to measure the minimal inhibitory concentration （MIC） of the eluent. Results There was a significant difference in antibacterial effect on different strains between the separated parts. The 30% ethanol eluent had the best inhibitory effect on Staphylococcus aureus and Shigella dysenteriae， with an MIC of 0.055 g/ml and 0.150 g/ml， respectively. The water extract had the best inhibitory effect on Streptococcus pneumoniae， with an MIC of 0.184 g/ml， while it had no inhibitory effect on Staphylococcus aureus and Shigella dysenteriae. The water extract， 10% ethanol eluent， and 30% ethanol eluent had little inhibitory effect on Pseudomonas aeruginosa， and 50% ethanol eluent with less polarity， 70% ethanol eluent， and 90% ethanol eluent had a weak inhibitory effect on Pseudomonas aeruginosa. Conclusion Different separated parts of Wuwei Xiaodu Decoction have a different inhibitory effect on different bacteria， which provide a theoretical basis and data support for the secondary development of the classic prescription Wuwei Xiaodu Decoction.
〔Keywords〕 Wuwei Xiaodu Decoction； NKA-9 macroporous resin； minimal inhibitory concentration； eluent
五味消毒飲是出自清代名著《医宗金鉴》的经典名方，由金银花、野菊花、蒲公英、紫花地丁、紫背天葵子组成，具有清热解毒、消散疔疮等功效，具有广谱抗菌作用，在临床上被广泛应用于临床各科中属于热毒所致的疾患，如内科泌尿系统、消化系统、呼吸系统、心脑血管系统等多种疾病，广泛用于多种炎症感染性疾病，如急性泌尿系统感染、带状疱疹、痤疮或外科疮痈疖肿等热毒炽盛的疾病，均有良好效果[1-4]。
目前对五味消毒饮中单味药的成分[5-6]，以及用大孔树脂对君药成分的吸附效果都已进行了深入研究，据报道NKA-9型大孔树脂的吸附效果较好[7-8]。现代药理学研究表明，五味消毒饮有广谱抗菌作用[9]，并具有对细菌耐药性低、调节免疫[10]等功效。
依据五味消毒饮的临床应用研究[11-13]，本实验研究了五味消毒饮水煎液的抗菌活性物质。我们选用于人类重要的革兰氏阳性病原菌黄色葡萄球菌、最为常见的人类细菌性痢疾病原菌革兰氏阴性杆菌志贺氏痢疾杆菌、能引起急性肠胃炎的乙型副伤寒杆菌、伤口感染较常见的绿脓杆菌以及对多种抗生素具备耐受性分布于人类上呼吸道、胃肠道、泌尿道及生殖道中的常见细菌肺炎链球菌共五种代表菌株。用NKA-9大孔树脂对五味消毒饮的水提液进行分离，得到不同部位的洗脱液，研究其对五种代表菌株的抗菌活性，为五味消毒饮经典复方抗菌药物的二次开发提供理论基础和实验依据。
1 材料
1.1 主要试剂与菌株
NKA-9型大孔树脂，购自天津欧瑞生物科技有限公司；金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus，ATCC25923）、痢疾杆菌（Shigella.dysenteriae，ATCC12022）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa，ATCC27853）、乙型副伤寒杆菌（Bacillus paratyphosus，CMCC50094）和肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，ATCC49619），以上菌种均由湖南中医药大学病原免疫实验室提供。
1.2 主要药材
金银花20 g，野菊花、蒲公英、紫花地丁、紫背天葵子各15 g。处方中金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thumb.的干燥花蕾或带初开的花；蒲公英为菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.的干燥全草；野菊花为菊科植物野菊Chrysanthemum indicum L.的干燥头状花序；紫花地丁为堇菜科植物紫花地丁Viola yedoensis Makino的干燥全草；紫背天葵子为毛茛科物天葵Semiaquilegia adoxioieds（DC.）Makino的块根。以上各药材均购自老百姓大药房，经湖南中医药大学药学院周日宝教授鉴定。
2 方法
2.1 固体培养基的制备
营养琼脂培养基的制备：MH琼脂高压灭菌后倾注于90 mm平皿，每个约25 mL，备用。
血平板培养基的制备：每500 mL双蒸水中加入20 g营养琼脂，高压灭菌后，冷至56 ℃加入无菌绵羊血25 mL，混匀后倾倒于70 mm平皿中，备用。
2.2 大孔树脂预处理
将NKA-9大孔树脂用无水乙醇浸泡24 h，充分溶胀，加入乙醇清洗至洗出液无白色浑浊后，并加入蒸馏水洗至无乙醇。加入2倍树脂柱体积（2BV）的5%NaOH溶液浸泡3 h，蒸馏水清洗至洗出液呈中性。最后加入2BV的5%盐酸水溶液浸泡3 h，用蒸馏水清洗至洗出液呈中性后备用。
2.3 五味消毒饮水提液的制备
按5付方剂量称取五味消毒饮生药材（不粉碎），共计400 g，加入10倍量蒸馏水浸泡60 min，煎煮30 min，然后加入8倍量蒸馏水煎煮20 min，最后再加入6倍量蒸馏水煎煮20 min，合并3次滤液，65 ℃减压浓缩至400 mL，得浓缩液（浓度为1 g/mL，每毫升溶剂含生药材1 g），备用。
2.4 五味消毒饮各洗脱液的制备
将预处理好的NKA-9大孔树脂10 g湿法装柱，用95%乙醇和适量蒸馏水洗脱柱子，直至洗脱液无白色浑浊为止，水洗至无醇味。将五味消毒飲的浓缩液上柱吸附2 h，依次用2BV的蒸馏水，10%、30%、50%、70%、90%的乙醇进行洗脱，将洗脱液减压浓缩，得到各浓缩液的浓度依次为1.47、2.60、3.49、1.20、3.62、2.70 g/mL（即每毫升溶剂含有的生药材量）。
2.5 抑菌活性的测定
2.5.1 牛津杯法测定抑菌圈 将浓度为1×106 cfu/mL的待检菌液均匀涂布于固体培养基上，金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和志贺氏痢疾杆菌使用营养琼脂平板，而肺炎链球菌和乙型副伤寒杆菌则均匀涂布于血平板上。将灭菌牛津杯用无菌镊子夹出，先置于酒精灯火焰上迅速过一下火，垂直放置于培养基表面，轻轻按压，使杯底与培养基之间无缝隙。每个平板放置4个牛津杯。每个牛津杯注入200 μL浓缩洗脱液，37 ℃培养24 h，量取抑菌圈的大小。
2.5.2 试管稀释法测定5种细菌的最低抑菌浓度 每支无菌试管中加肉汤培养基l mL，第1管加所试药液混匀后，使1～9管均含有倍比稀释的洗脱液的比例分别为1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024，每管加菌液0.05 mL（1×106cfu/mL），并设阴性对照组（MH液体培养基）和阳性对照组（加菌，不加药液）。37 ℃条件下培养24 h，以不生长菌落的最高药物稀释浓度为对该种细菌的最低抑菌浓度（MIC）。
2.6 统计方法
五味消毒饮不同分离部位的抑菌圈数据以“x±s”表示，多组间数据的采用SPSS 19.0软件进行χ2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
3 结果
3.1 抑菌圈法定性检测五味消毒饮分离部位的抗菌效果
从抑菌圈直径分析，五味消毒饮不同分离部位对同一菌株的抑菌圈直径存在很大差异，其中30%乙醇洗脱液对金黄色葡萄球菌的抑制效果最强，结果如表1所示。对金黄色葡萄球菌：30%、10%、90%的乙醇洗脱液表现出明显的抑菌活性，其中30%的乙醇洗脱液最强，而水洗液及50%、70%乙醇洗脱液对金黄色葡萄球菌无抑制作用；对志贺氏痢疾杆菌：除水洗液及90%乙醇洗脱液外的其它分离部位都表现出抑菌活性（P<0.05），其中30%乙醇洗脱液最强，而水洗液及50%、70%乙醇洗脱液对金黄色葡萄球菌无抑制作用；对志贺氏痢疾杆菌：除水洗液及90%乙醇洗脱液外的其它分离部位都表现出抑菌活性，其中30%乙醇洗脱液的抑菌活性最强，而10%和50%乙醇洗脱液相差不大，且强于70%乙醇洗脱液；对肺炎链球菌：只有90%乙醇洗脱液没有抑制作用，其它分离部位的抑菌活性显著（P<0.05）；对乙型副伤寒杆菌：水洗液、50%和30%乙醇洗脱液的抑菌圈直径相差不大；对绿脓杆菌：70%乙醇洗脱液的抑制效果较好，但其抑菌圈较小实际意义不大。
同一分离部位对不同菌株的抑菌圈分析可知，30%乙醇洗脱液的对不同菌株的抑制效果差异最大：金黄色葡萄球菌>志贺氏痢疾杆菌>肺炎链球菌>乙型副伤寒杆菌>绿脓杆菌。而10%乙醇洗脱液的抑制效果：金黄色葡萄球菌>志贺氏痢疾杆菌（肺炎链球菌）>乙型副伤寒杆菌（绿脓杆菌）。水洗液对肺炎链球菌和乙型副伤寒杆菌的抑制效果较好。50%乙醇洗脱液对志贺氏痢疾杆菌、肺炎链球菌、乙型副伤寒杆菌的抑制作用没有明显差异，但强于对绿脓杆菌的抑制作用。70%乙醇洗脱液对志贺氏痢疾杆菌和肺炎链球菌的抑制效果相差不大，但强于对绿脓杆菌的抑制效果。90%乙醇洗脱液只对金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌有抑制作用，且对前者的抑制作用明显强于后者。
3.2 MIC定量比较五味消毒饮分离部位的抗菌效果
依据“3.1”项的实验结果，对抑菌效果较好的分离部位用试管稀释法确定其MIC，每个实验重复5次，结果如表2所示。MIC数据显示，每种分离部位对不同菌株的抑制作用不同，水洗液对肺炎链球菌的抑制效果强于对乙型副伤寒杆菌的抑制作用（P<0.05）。10%乙醇洗脱液对金黄色葡萄球菌、志贺氏痢疾杆菌的抑制作用强于对肺炎链球菌和乙型副伤寒杆菌，但效果明显小于30%乙醇洗脱液对金黄色葡萄球菌、志贺氏痢疾杆菌的抑制作用，后者MIC分别为0.055 g/mL、0.109 g/mL。50%乙醇洗脱液对志贺氏痢疾杆菌的MIC为0.150 g/mL，抑制作用强于对其它菌株的抑制作用（P<0.05）。70%乙醇洗脱液的抗菌活性明显较差（P<0.05），其中对志贺氏痢疾杆菌的MIC最小，为0.453 g/mL。90%乙醇洗脱液对金黄色葡萄球菌有抗菌效果较明显，MIC为0.338 g/mL。
4 讨论
五味消毒饮中的君药为金银花，具有清热解毒、消散痈肿的功效。紫花地丁、紫背天葵子具有清热解毒、消散疔疮的作用，蒲公英、野菊花具有清热解毒、消散痈肿的功效，这四味均为辅佐药，各药合用，增强清热解毒的功效。本实验中复方水煎液的30%乙醇洗脱液对金黄色葡萄球菌的抗菌效果最强，文献报道金银花单味药的黄酮成分金丝桃苷，对于金黄色葡萄球菌的作用很强[14]。而且金丝桃苷只有一个六元糖极性较大，所有在五味消毒饮中30%乙醇洗脱液中的含量相对较高，所以对金黄色葡萄球菌的抗菌效果最强，充分说明君药金银花在复方中起的重要作用。绿原酸是金银花的主要抗菌成分，其对绿脓杆菌藻酸盐的大量产生，降低生物膜的复杂性，并减小生物膜的产生。與抗生素联合使用效果更加，能明显减小绿脓杆菌耐药性的产生[15]。而在本实验中由于提取浓缩五味消毒饮时间较长，可能会破坏其绿原酸的结构，从而导致各提取部位对绿脓杆菌的抑制效果很差。
实验结果证明，同一分离部位对不同菌株，以及不同分离部位对同一菌株，均有差异。其中，30%乙醇洗脱液的对金黄色葡萄球菌和志贺氏痢疾杆菌抗菌效果最好，抑菌效果随药液浓度的增大而增强。对金黄色葡萄球菌的MIC为0.055 g/mL，对志贺氏痢疾杆菌的MIC为0.109 g/mL。湿疹患者的患部大多数（80%）细菌培养阳性，并且全部是葡萄球菌属[16]，其中金黄色葡萄球菌最多，因此五味消毒饮的30%乙醇洗脱液分离部位有希望开发为治疗湿疹的药物。而极性较大的水洗液部位对金黄色葡萄球菌抗菌、志贺氏痢疾杆菌、绿脓杆菌没有抑菌效果，对乙型副伤寒杆菌效果较好，对肺炎链球菌的抑制效果最佳，随浓度升高抑菌效果增强，MIC为0.184 g/mL，因此五味消毒饮的大孔树脂水洗液部位更利于抗呼吸系统和消化系统感染药物的开发。五味消毒饮复方水煎液各分离部位的具体抗菌成分及抗菌机制有待深入研究。
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